Source: SEAMEO BIOTROP's Research Grant | 2008
Abstract:
Sucrose synthase (SUSY) dan sucrose phosphate synthase (SPS) merupakan enzim yang berperan dalam jalur biosintesis sukrosa pada tumbuhan. Kedua enzim ini berturut-turut mengkatalisis reaksi reaversible dan irreversible dari UDP-glukosa menjadi sukrosa, karena itu keduanya mempengaruhi kadar sukrosa di dalam jaringan suatu tumbuhan. Lontar (Borassus flabellifer L.) merupakan tumbuhan tahan kekeringan yang menghasilkan gula pada bunganya. Kadar gula yang dihasilkan nira dari bunga B. flabellifer berfluktuasi pada musim yang berbeda. Oleh karena itu mekanisme kontrol lingkungan terhadap ekspresi gen-gen terkait sintesis sukrosa pada B. flabellifer menjadi hal yang penting untuk dipelajari. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen pengkode SUSY dan SPS dari B. flabellifer serta mempelajari karakter dari kedua gen tersebut sebelum mempelajari lebih jauh tentang level ekspresinya. RNA total dari daun muda B. flabellifer terlebih dahulu diisolasi dengan metode yang dimodifikasi dari Apt et al. (1995). Sepasang primer spesifik SUSY dan SPS digunakan untuk mengamplifikasi fragmen kedua gen dari sampel RNA dalam reaksi RT-PCR. Pasangan primer untuk setiap gen dirancang dari daerah lestari pada gen-gen analog SUSY dan SPS dari beberapa jenis tumbuhan, seperti padi, jagung, tebu, dan gandum. Melalui RT-PCR, RNA pengkode SUSY dan SPS dapat ditranskripsi balik menjadi fragmen gen SUSY dan SPS. Optimasi kondisi RT-PCR, meliputi temperatur penempelan primer dan konsentrasi Mg2+, dilakukan untuk mengetahui kondisi terbaik untuk mengamplifikasi fragmen kedua gen. Fragmen gen putatif SUSY sepanjang ± 1900 bp diperoleh pada temperatur annealing 530C, sedangkan fragmen gen putatif SPS sepanjang ± 2200 bp diperoleh pada temperatur yang lebih rendah, 500C. Konsentrasi Mg2+ sebesar 0.5 mM optimal untuk mengamplifikasi kedua gen. Untuk memperbanyak kopi gen putatif SUSY dan SPS, fragmen masing-masing gen diklon ke dalam vektor plasmid pGEM-T Easy kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli. Sel-sel transforman E. coli yang mengandung plasmid yang telah terinsersi gen target diseleksi dengan skrining biru-putih, diikuti tahap isolasi plasmid. Keberadaan fragmen gen putatif SUSY dan SPS pada plasmid kemudian dikonfirmasi dengan pemotongan plasmid menggunakan enzim restriksi endonuklease, EcoRI. Fragmen DNA berukuran ± 1900 bp dan ± 2200 bp yang ditunjukkan dari hasil uji restriksi, sesuai dengan ukuran yang diharapkan untuk gen SUSY dan SPS, mengindikasikan bahwa fragmen putatif kedua gen telah diperoleh dari B. flabellifer. Untuk mengkonfirmasi bahwa kedua fragmen yang diisolasi tersebut adalah merupakan gen SUSY dan SPS, proses pembacaan sekuens kedua fragmen hingga saat ini masih dilakukan oleh jasa Macrogen, Inc. Sekuens nukleotida dari kedua gen selanjutnya akan dianalisa dengan program nucleotida BLAST untuk membandingkan kemiripannya dengan gen-gen analog SUSY dan SPS dari jenis-jenis tumbuhan lain. Pemetaan restriksi dan prediksi urutan asam amino juga akan dilakukan menggunakan program BioEdit.Download full report